参比购-【药研分析】解读各国药典对HPLC方法的规定

　　所谓药典方法，顾名思义，药典专论所收载的方法，但是否每个人都知道，药典方法考虑到各个实验室的差异，有一定的可调范围。下面我们具体的来探讨一下这个问题吧!

　　一、中国药典2015规定

　　0512高效液相色谱法规定如下：品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例 X 小于33%时，允许改变范围为0.7X 〜1.3X ; 当X大于33%时，允许改变范围为X —10%〜X+ 10%。

　　由上文可知，中国药典专论方法除填充剂种类、流动相组分(比例调整在规定范围内)、检测器类型不得改变外，其他条件改变了，还是认为是药典方法。但中国药典没有规定方法确认之说，所以，即使是中国药典方法，也是应该按分析方法验证的相关规定进行全套的方法验证。

　　二、美国药典41规定

　　USP41 <621> CHROMATOGRAPHY 规定如下：

　　为符合系统适用性的要求而调整的操作条件是允许的，除非专论项下另有规定，下面为所列的最大的可调范围，这些调整需要额外的确认数据。为确认新条件对方法的适用性，评估调整对相关分析性能特征存在的潜在影响。多条件的调整，将对系统性能产生累积影响，实施前需仔细考虑。

　　1、pH of mobile phase(HPLC): 流动性缓冲液的pH:±0.2 units，适用梯度及等度。

　　2、Concentration of salts in buffer (HPLC): ±10%(pH允许情况下)，适用梯度及等度。

　　3、Ratio of componentsin mobile phase (HPLC):

　　流动相中组分(≤50%)可以在此比例上再调节±30%，且任一组分比例的调节不应超过±10%(相对于总的流动相)，含三组分的流动相的调节可以分组分进行，含双组分的流动相的调节可在最小的组分进行，双组份和三组分的调节实例如下：

　　双组分：例如流动相50:50，其中一组分50%的30%是15%，但是它超过了占总体比例±10%的规定，所以这个流动相比例的调节范围应以±10%为限，可以在不超过40:60~60:40的范围之间调节。再例如流动相比例为2:98，其中小组分2%的30%是0.6%，这个值不超过占总体比例±10%的规定，此流动相的比例可以在不超过1.4:98.6~2.6:97.4的范围之间调节。

　　三组分：例如流动相60:35:5，它的次组分35%的30%是10.5%，但是它超过了占总体比例±10%的规定，所以这个流动相比例中的次组分的调节范围应以±10%为限。对于最小组分5%的30%是1.5%。可以在不超过50:45:5~70:25:5或58.5:35:6.5~61.5:35:3.5的范围之间调节。

　　4、Wavelength ofUV-visible detector (HPLC): 专论中规定的检测波长不允许改变，检测器供应商的程序或另一个验证程序来说明，波长检测误差，最多不得超过±3nm。

　　5、Stationary phase

　　Column length (GC): 可以在±70%范围内调节。

　　Column length (HPLC): 见粒径项下。

　　Column inner diameter (HPLC): 如果线速度保持恒定，可以调整。见HPLC流速。

　　Column inner diameter (GC): 最大可调整至±50%。

　　Film thickness (capillaryGC): 最大可在−50% to100%调整。

　　6、Particle size(HPLC): 等度洗脱：粒度和柱长均可以修改，但柱长与粒度的比值(L/dp)恒定或在规定柱长与粒度的比值的-25%~+50%范围内。或者(当粒度通过表面多孔颗粒调整时)，其它柱长(L)和粒度(dp)的柱子可以使用，但理论塔板数N应在规定柱的-25%~+50%范围内。如果调节导致更高的理论塔板数时应注意，这样将产生更小的峰容量，应通过缩小额外柱外峰拓宽的因素调整，例如仪器的管路、检测器的体积、采样速率和进样体积。当专论中未规定粒度时，该比值应采用规定柱的最大粒度计算。

　　7、Particle size (GC): 如果色谱图的符合系统适用性要求以及粒径范围比相同，粒度大小可以从大变小或从小变大，粒径范围比的定义是最大粒度直径除以最小粒度直径。

　　8、Flow rate (GC): 流速可以最大在±50%调整。(备注：如果专论中规定了线性速度参数，如果载气系统可以按设置的控制，线性速度可以在 +50%~ −25%范围内调整)

　　9、Flow rate (HPLC)：当粒度改变时，流速也许需要调整，因为为达到相同的性能，小粒度的柱子需要更高的线速度(测量通过较少塔板高度)，流速、柱内径、粒度通过下面公式换算。

F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]

　　其中：

微信图片_20200221101427.png

　　对于等度洗脱，如果粒度从≥3μm变化到<3μm时，将增加线速度(通过调整流速)，如果柱效不下跌20%以上，相同地，如果粒度从<3μm变化到≥3μm时，应减少线速度(流速)来避免柱效降低20%以上。梯度洗脱：流速、柱内径、粒度将不允许调整。另外，流速可以在±50%调整。(只适用于等度洗脱)

　　三、欧洲药典9 规定

　　EP 2.2.46 ChromatographicSeparation Techniques 规定如下：

　　1、液相色谱-等度洗脱

　　(1)Composition of themobile phase：小组分的数量可以在相对±30%或绝对±2%范围内调节，两者取其大。(例如：流动相中次组分占10%，按相对±30%它的可调范围在7%~13%，按绝对±2%它的可调范围在8%~12%，取较大者7%~13%;再例如：次组分为5%时，按相对±30%它的可调范围在3.5%~6.5%，按绝对±2%它的可调范围在3%~7%，取较大者3%~7%)，但须确保组分的绝对调节量不得超过10%。

　　(2)pH of the aqueouscomponent of the mobile phase：除非专论中另有规定，用于配制流动相的pH可以在规定的值或范围的±0.2以内调节。如果待测品为非电离物质(中性物质)，pH可在±1.0范围内调节。

　　(3)Concentration ofsalts in the buffer component of a mobile phase：用于配制流动相的含水缓冲液的盐的浓度可在±10%范围内调节。

　　(4)Flow rate：一般调节范围为±50%，若柱尺寸改变了，流速可以更大范围内调节，具体可按下述公式来计算。

　　(5)Column parameters：

　　Stationary phase：固定相的属性不能改变(例如：不能用C8来代替C18);

　　particle size：最多可减小50%，不允许增加。

　　Column dimensions:长度可以±70%范围内调节，内径可在±25%范围内调节。当柱的尺寸改变时，流速通过下面公式进行调节。

F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]

　　其中：

微信图片_20200221101440.png

　　(6)Temperature：当专论中规定了柱温时，可以±10℃范围内调节，除非另有规定。

　　(7)Detector wavelength：不允许改变。

　　(8)Injection volume：若待检峰的灵敏度和重复性好的话可以减小，不允许提高。

　　2、液相色谱-梯度洗脱

　　梯度洗脱的液相条件调节需比等度洗脱的更加慎重。流动相的组成/梯度洗脱可以在符合下述条件的前提下进行小范围的调节：

　　满足系统适应性的条件;

　　主峰的出峰时间在原定保留时间的±15%以内;

　　流动相中最终组分的洗脱能力的强度不得弱于原规定组分;

　　如果系统适应性的条件达不到，则通常首选考虑滞留体积或更换柱子。

　　(1)Dwell volume滞留体积(死体积)：仪器的结构将会大大的改变分离度、保留时间、相对保留时间，如果这些发生，是由于滞留体积过多。专论中通常在梯度洗脱时先进行等度洗脱。考虑到方法开发系统和实际系统的滞留体积的不同，所以梯度洗脱的时间应该足够。所以使用者在进行方法确认时应确认等度洗脱的时间。如果洗脱时的滞留体积在专论中有规定，则开始洗脱的时间点(t min)应该被调节时间点(tc min)替代。用下面公式计算

微信图片_20200221101442.png