提示
药物杂质是指任何影响药物纯度的物质,它是反映药物质量的重要指标。药物中的杂质一方面导致药物活性成分含量降低,影响药物的治疗效果;另一方面毒性杂质在用药过程中会威胁人类的健康。因此必须选择合适的分析技术进行研究,确定其来源,并对其结构进行鉴定。液质联用技术灵敏度高、专属性强、重现性好,能提供丰富的结构信息,是目前药物杂质结构鉴定分析领域应用最为广泛的一种技术。本文对近年来液质联用技术在抗生素药物、喹诺酮类药物、沙坦类药物及其他药物中杂质的结构鉴定方面进行综述,并对其发展趋势进行展望。
任何影响药物纯度的物质统称为杂质。药物中含有杂质会降低疗效和影响稳定性,有的甚至对人体健康有害或产生其他不良反应。因此,对杂质进行检测,鉴定其可能的结构,分析其来源,对控制药物质量至关重要。药品研究者、生产者应尽可能地明确药品中各类杂质的结构、来源、毒性、检测方法以及质控限度。按人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)要求,对原料药中含量大于0.1%的杂质需要进行结构鉴定。能否快速地鉴别出药物中杂质的结构,关系到“杂质谱控制”理念应用的成败[3],也是当代药物分析中的重要内容之一。液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)是20世纪70 年代发展起来的一门新的仪器分析方法,是一种以液相色谱为主要分离手段,质谱法作为检测手段的色谱检测技术,集合了液相色谱仪(LC)的高分离能力和质谱仪(MS)的高灵敏度、高专属性的特点,简化了复杂混合物的分离纯化过程。液质联用技术已经成为药物中微量杂质分析的首选技术,特别是多级质谱和高分辨质谱的发展和应用,能够在线获得化合物的丰富片段信息和分析组成信息,可根据一级、二级甚至多级质谱信息确定化合物的分子量并推断出可能分子结构,为药物杂质的结构鉴定提供快速、准确的方法。近二十年来,随着液质联用技术发展的日臻完善,其在药物杂质结构鉴定研究中的应用也越来越广泛,展现出广阔的应用前景。本文对近年来液质联用技术在抗生素药物、喹诺酮类药物、沙坦类药物及其他药物中杂质的结构鉴定方面的研究进行综述,对其鉴定出的杂质进行归类总结。
1、β-内酰胺类药
β-内酰胺类药物一般由微生物发酵产生并经纯化、精制以及化学修饰等过程制得,主要分为青霉素类、头孢菌素类等典型的β内酰胺和非典型内酰胺如青霉烯、氧头孢、碳头孢、单环内酰胺等,这些抗生素的分子结构中均含有β-内酰胺环。分析β-内酰胺类抗生素的杂质结构应首先推测其杂质来源。可根据产品的生产工艺、反应条件,以及各种起始物、中间体和终产物的理化性质,推测产品中可能出现的各种杂质;也可设计加速试验或强制降解试验如热、酸、碱、氧化、光照等,使药物发生降解,再进行相关的仪器分析。
了解药物的MS裂解规律,有助于对杂质结构的推测。虽然不同仪器和不同离子化方式所得到的碎片峰的质量数和离子丰度不完全相同,但是仍有一定规律可寻。在MS分析中,所有β-内酰胺类抗生素共有的裂解反应是β-内酰胺环开裂,其他易发生断裂的部位有7位侧链酰胺键、2位碳上的羧基、氨噻肟头孢菌素亚氨结构上的甲氧基等。
近年来,采用LC-MS分析并鉴定β-内酰胺类抗生素杂质结构的报道很多,表1总结了近20年来该类药物的杂质结构鉴定情况。
2、氨基糖苷类药物
氨基糖苷类药物是由氨基环醇、氨基糖和糖组成的抗生素总称,其化学结构都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷。氨基糖苷类抗生素易发生耳毒性损害、药热性死亡及肾损害,这与其相关杂质有必然的联系。由于该类抗生素结构中不具备特征的紫外发色团,不宜采用紫外检测器进行相关杂质研究。利用液质联用技术鉴定该类抗生素的杂质结构,有助于分析其引起不良反应的起因。
硫酸庆大霉素是氨基糖甙类广谱抗生素,由小单孢菌发酵经提炼而得,含多种有效成分和杂质。林梅建立了硫酸庆大霉素LC-MS 方法,根据质谱碎片并结合相关文献,推断出硫酸庆大霉素产品中含有加纳糖胺、庆大霉素A3、庆大霉素X2、庆大霉素B、庆大霉胺C2、JI-20A、Ⅶ-3、庆大霉胺C2a、庆大霉素B1和西索霉素等有关物质,为硫酸庆大霉素实际生产和质量控制提供科学依据。杨昊等建立高效液相色谱-电喷雾-离子阱色谱法(HPLC-ESI-IT-MSn)法研究庆大霉素C1a 原料中的杂质谱,明确了庆大霉素C1a样品中含有庆大霉素A、庆大霉素B、西索米星、小诺霉素、威达米星或它们的同分异构体和同系物,并含有庆大霉素C1a 或上述杂质的降解产物。
硫酸奈替米星为半合成的氨基糖甙类抗生素,抗菌谱与庆大霉素相似。袁耀佐等应用高效液相色谱-电喷雾-离子阱质谱法快速鉴定出硫酸奈替米星样品中7个有关物质的结构,分别为西索米星、去甲基西索米星、1-N-乙基-加洛糖胺、5-O-乙基-奈替米星、2'-N-乙基-奈替米星、3″-N-乙基-奈替米星和3-N-丙基-依替米星。
小诺霉素又称相模霉素或沙加霉素,是由小单孢菌产生的氨基糖苷类抗生素,是庆大霉素C2b组分。袁耀佐等用宽pH 范围的Gemini NX C18 (4.6mm×150 mm,5 μm)色谱柱,采用诊断碎片离子推断策略的结构推定方法,从硫酸小诺霉素原料中检出15个有关物质,并对其中的14 个物质结构进行归属。
3、四环素类药物
四环素类药物是一类以含有四个芳香环的并四苯为结构基础的广谱抗生素,由于药物本身的结构特点,其对各种氧化剂、酸和碱都不稳定。该类抗生素在生产和贮存过程中以及进入环境后发生降解会产生一些代谢和降解产物,主要是差向异构体和脱水产物。李秀琴等采用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱(UPLC-HRTOF/MS)鉴定出四环素中的4 种杂质,分别为差向四环素、金霉素、差向脱水四环素和脱水四环素。
多西环素又名强力霉素或脱氧土霉素,是一种多以土霉素作为起始原料的半合成抗生素。杨帆等[29]利用LCMS-IT-TOF/MS质谱仪获得多西环素杂质F的[M+H]+ 为m/z 444.165 4,MS3、MS4、MS5 前体离子为m/z 366.136 4、293.080 7、278.067 2,推测出其可能的质谱裂解途径和分子结构。张锦琳等应用在线脱盐-高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(2D-LC-IT-TOF/MS) 法鉴定4个盐酸多西环素片的有关物质结构,分别为4-表多西环素、美他环素、β-多西环素、2-乙酰-6-脱碳酰胺多西环素。
金霉素是由链霉菌产生的一种四环素类抗生素,主要作为兽用抗生素大量使用。方东升应用液相色谱-电喷雾离子化质谱法分析饲料级金霉素样品的杂质组分,并根据各组分的准分子离子峰[M+H]+鉴定出该样品中含有四环素、差向异构四环素和差向异构金霉素杂质等组分。
4、大环内酯类药物
大环内酯类药物按其母核结构,主要可分为十四元环和十六元环两大类:前者主要为红霉素及其衍生物,后者主要为螺旋霉素和吉他霉素的衍生物。大环内酯类抗生素杂质基本保留了原药分子的骨架结构,因此大多具有相似的质谱裂解途径、中性丢失(H2O、CH3OH 等)和碎片离子(糖基片段、内酯环片段等)。
许卓妮等通过Orbitrap Elite 高分辨质谱仪对阿奇霉素降解产物进行高分辨元素组成分析和二级质谱的测定,研究其中4个主要降解产物并推测其结构,认为阿奇霉素经酸降解和高温破坏得到的杂质主要是去氧糖胺基阿奇霉素,经氧化降解的杂质主要是阿奇霉素-N-氧化物,经碱破坏的主要产物为内酯环开环水解、脱水或糖基片段丢失。
Wang等[35]采用《中国药典》2010年版项下的液相色谱条件、正电离模式的电喷雾离子源串联质谱法对乙酰螺旋霉素中的未知组分进行解析,共检出主组分在内的83种组分,其中包括31种新杂质和31种部分解析的杂质 (异构体或者糖基变异);主要杂质来源于起始原料和合成工艺。
Leonard等利用高效液相色谱-质谱联用法检测克拉霉素原料药中的11种有关物质,通过二级质谱和三级质谱的碎片离子信息,确定各相关化合物的结构,其中包括9 位羰基碳被氮原子取代形成的杂质。
Chitneni等利用高效液相色谱-质谱联用法鉴定红霉素降解杂质的结构,其中红霉素经酸降解时6、9位和9、12位连接成环,形成脱水红霉素C杂质,经碱降解时内酯环断裂形成伪红霉素E烯醚杂质。
vanden Bossche等利用液质联用仪鉴定出交沙霉素中的18个有关物质,其中包括羟基移到13位产生的杂质,还有双键位置在9、10位和11、12位分别产生的杂质。
5、喹诺酮类药物
喹诺酮类,又称吡酮酸类或吡啶酮酸类,是一类含4-喹诺酮基本结构的人工合成抗菌药。该类药物的不良反应在很大程度上与药物的母核结构、取代基的种类和取代位置等相关。对喹诺酮类药物中杂质进行系统的分析研究,鉴定其结构,对提高杂质控制标准,保证临床疗效和病人用药安全均有重要的意义。
王维剑等通过HPLC-MS对左氧氟沙星经酸、氧化、光照破坏的样品进行分析,结果发现左氧氟沙星酸降解产物为去羧基左氧氟沙星,氧化降解产物为左氧氟沙星-N-氧化物,两个光照降解产物分别为去甲基左氧氟沙星、左氧氟沙星-N-氧化物。
郑亚杰采用LC HRMS/MS联用技术,建立适用于喹诺酮类药物中微量或未知杂质的整合性结构分析方法,对左氧氟沙星、环丙沙星和莫西沙星经强制破坏试验处理后的样品进行综合分析,并鉴定出5个左氧氟沙星相关杂质的结构。另外,该研究对莫西沙星和环丙沙星等一批代表性的喹诺酮类药物,以及经过强制破坏试验处理后的样品进行综合分析,一共鉴定出5个莫西沙星相关杂质和13个环丙沙星相关杂质的结构。
贺玖明等采用高分辨液相色谱(RRLC)对莫西沙星原料在30% H2O2 中的氧化降解产物进行分离,分别设定高低碰撞能量的TOF-MS实验采集质谱数据,获取母离子与碎片离子等质谱信息,从而得到10个该药物降解杂质的结构及相对含量。
黄婧等采用高效液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪测定依诺沙星的有关物质准确母离子及子离子,并结合裂解规律、对照品和依诺沙星生产工艺,对3种主要有关物质进行结构推定,认为三者均具有依诺沙星的1,8-萘啶母核结构。
6、沙坦类药物
沙坦类药物即血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类抗高血压药物,是继血管紧张素转化酶抑制剂之后的一类新型降压药。沙坦类药物的杂质研究多是通过HPLC法进行。近年来,随着液质联用技术的应用越来越广泛,分析并鉴定该类药物杂质结构的报道越来越多。
缬沙坦是由瑞士诺华公司开发,1996年获美国FDA 批准,是目前全球处方量最大的沙坦类药物。刘朝霞等对8个厂家的175批缬沙坦胶囊进行有关物质的检测分析,并采用LC-MS/MS技术分析推断出缬沙坦杂质F的结构,命名为缬沙坦乙酯。
王燕等采用LC-MS/MS法对复方缬沙坦氨氯地平片中有关物质进行定性分析,并根据有关物质的PDA 谱、质谱母离子及子离子谱进行解析,鉴别出11个复方缬沙坦氨氯地平片中有关物质的结构。
吴强等采用四级杆复合线性离子阱液质联用仪对阿齐沙坦的光降解产物和酸降解产物进行结构推测,鉴定出光降解主要产物为1-( ( 2'-1H-双吖丙啶-3-基-[1,1'-联苯]-4-基) 甲基)-2-乙氧基-1H-苯并[d]咪唑-7-羧酸,酸降解主要产物为2-氧代-3-(( 2'-(5-氧代-4,5-二氢-1,2,4- 噁二唑酮-3-基)-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-4-羧酸。
方玉玲等采用液相色谱-光电二极管阵列检测器-四极杆飞行时间质谱联用(LC-PDA-QTOF--MS) 对氯沙坦钾中工艺杂质进行结构确认及分析,确定氯沙坦钾成品质量的RRT 1.12杂质为氯沙坦羧酸衍生物,该杂质产生的主要原因是反应过程中关键原料氯腈进行四氮唑反应不完全,在后处理过程中水解产生的。
7、其他药
随着液质联用技术不断地成熟,在进行杂质谱研究的过程越来越多的研究者更倾向于利用该技术进行结构鉴定。彭玉薇等采用高效液相色谱离子肼质谱串联技术在线鉴定氨氯地平原料药中未知杂质的结构,得到3个未知杂质分别为二甲酯式氨氯地平、甲酯异丙酯式氨氯地平、异丙酯乙酯式氨氯地平。庾莉菊等采用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用技术(UPLC-MS/MS)对青蒿素样品中的主要杂质进行结构确认,其中杂质Ⅰ为青蒿烯,杂质Ⅱ可能为青蒿素的异构体。熊婧等采用超高压液相-质谱(UPLC-MS)联用技术鉴定盐酸苄丝肼中的未知杂质为盐酸三羟苄基苄丝肼。彭琳等采用液质联用-电喷雾负离子模式,通过比较杂质和对照品的质荷比对注射用兰索拉唑的杂质进定性研究。吴川彦等采用高效液相-飞行时间-质谱法(HPLC-Q-TOF-MS)对米诺地尔及凝胶有关物质的分析,推断出8个杂质的结构,均为新发现的降解产物。
8、展望
液质联用技术将高分离能力的色谱技术和高定性能力的质谱技术相结合,不但拥有色谱法的优点,还弥补了色谱法的一些不足。该技术在使用色谱法对药物中的有关物质进行有效分离的基础上,进一步利用一级、二级甚至多级质谱碎片信息推测其有关物质的结构,提高定性能力,避免传统的分离、制备等较为繁琐的前处理过程,更有利于多组分的药物识别。随着液质联用技术的不断进步,该技术已成为能够快速准确地发现及鉴定药物中杂质结构的最优方法。
液质联用技术尽管在药物及杂质分析领域表现出一定的优势,但在实际的应用中同样也存在一定的问题与不足,需要进一步的完善。该技术在通过二级或多级质谱碎片信息进行结构推导时,无法对结构中部分基团的位置或空间构型进行确定;而且得到的质谱信息量大,需要较为繁琐的数据处理过程,尚未有较为全面的数据库可查询,这是利用该技术进行结构鉴定的一个缺陷。由于杂质在样品中含量极微,用富集的制备方法获得杂质精制品的工作量大,甚至还需要特殊的设备,成为药物杂质谱研究的瓶颈所在。期待有更先进的分析手段来加速发展并推动这方面工作的深入研究。
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