51、通常我们在分析天然药物成分的时候结构复杂，无法考察组分的PKa值，哪我们如何去选择最合适的流动相或者是拖尾该怎么改善呢?

　　答：如果天然产物中没有易电离的极性基团，就不需要用缓冲盐调节pH。如果天然产物中既有酸性基团，也有碱性基团，譬如有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的两性物质，建议将pH用磷酸盐缓冲盐控制在2.4(如果是诸如月旭的Ultimate LP-C18这样的耐酸色谱柱，还可以调得更低)。

　　如果pH控制在6.2-9.0之间，两个基团都处于离子态，保留能力最差，是最不可取的。如果不清楚复杂物质中含有什么基团，也请将pH调到2.4或更低。因为pH调低，起码抑制了酸性基团的电离而处于中性分子状态，而增加酸性基团这个部分在反相色谱中的保留能力;另外低pH还抑制了硅醇基的活性，有利于获取对称的峰形。

　　情况不明时候，为什么不建议调高pH呢?一方面一般色谱柱都不能承受pH9以上的条件;即使是像月旭的Xtimate系列一样能耐12.5的柱子，调高pH和调低pH相比，还有一个硅醇基活性大的劣势。

　　52、记得以前拿到C18柱，会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化，这样做的目的是什么呢?是先用溶剂活化吗?然后再用样品?还有测定短肽总是冲出来，该怎么解决呢?就是和溶剂峰出在一起，或者出在溶剂峰之前。

　　‍答：C18柱，会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化，因为色谱柱到达用户手中时，时间长短不一，在存储和运输的过程中，可能存储液有些挥发，低流速的甲醇可以很好的浸润固定相，使键合相很好的伸展，用溶剂平衡好系统后，可以采取多次进样或者加大进样量的方式以更快的获得重现的色谱图，这样用样品将色谱柱中的活化点饱和，就不会出现异常色谱现象的情况。

　　53、C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性环境中，会对柱子有什么损坏吗?ph在2左右。

　　答：pH2左右容易使键合在硅胶基质上的固定相水解流失，包括C18和封尾试剂的水解，封尾试剂相对更容易水解。不知道你保存的酸性环境是不是含有缓冲盐，如果不含缓冲盐，只是短期几天保存在酸性流动相中，也不必过份担心，最多相当于这几天一直在使用这根色谱柱，因此减少几天的使用寿命吧;有缓冲盐就麻烦一点，保存期间水分挥发可能会导致缓冲盐结晶在柱内析出，对柱子损伤很大。

　　54、色谱柱的安装有什么技巧吗?只要保证不漏就行了吗?还有所谓的死体积怎么测定呢?

　　答：色谱柱安装技巧不多，只要接头和柱头匹配，确实拧紧不漏就可以了，但也要注意不要拧得太紧以至于损伤螺纹。所谓死体积就是完全不保留的物质出峰时从进样到流过色谱柱的总体积，一般用极性非常强的尿嘧啶的出峰来测定。死体积包括柱体积(色谱柱内溶剂能占据的空腔体积)和柱外体积两部分。

　　你从厂商这里买到色谱柱，柱体积已经是固定了，你能尽量避免减少的是柱外体积。进样器内死体积、毛细管长度、毛细管和色谱柱连接紧凑与否，保护柱或在线滤器产生的死体积大小，都对这个有影响。样品在柱内，除扩散外，还有和填料作用引起的组分分离;但样品在柱外，那就只有扩散这个使柱效下降的因素了。所以，要取得好的分离效率，柱外体积应该是越小越好。

　　峰有时候前延，有时候拖尾，一般不是色谱柱的问题，应该是样品和色谱柱填料的作用问题，可以说如果色谱柱类型选择没问题，关键就是色谱条件的选择。包括进样量、样品溶剂、流动相组成(包括添加剂)、流动相pH以及柱温，都对峰形有影响。另外测定分子量较大的多肽，用样品老化平衡色谱柱很重要，分子量越大的物质，需要平衡时间越长。如果柱子没平衡好，峰形也可能会不正常。所以最好把你具体的测定条件也列一下，也便于有针对性的分析原因。

　　55、测定多肽样品时，十几肽或者二十几肽时，有时峰前延的比较厉害，有时峰拖尾比较厉害，这是什么原因呢?是样品的问题还是柱子的问题?

　　答：峰有时候前延，有时候拖尾，一般不是色谱柱的问题，应该是样品和色谱柱填料的作用问题，可以说如果色谱柱类型选择没问题，关键就是色谱条件的选择。包括进样量、样品溶剂、流动相组成(包括添加剂)、流动相pH以及柱温，都对峰形有影响。另外测定分子量较大的多肽，用样品老化平衡色谱柱很重要，分子量越大的物质，需要平衡时间越长。如果柱子没平衡好，峰形也可能会不正常。所以最好把你具体的测定条件也列一下，也便于有针对性的分析原因。

　　56、柱子的平衡时间跟填料关系大吗?哪种最快，哪种最慢?因为我在做离子交换柱的时候平衡是相当的慢。

　　答：根据色谱速率理论，粒径越小，柱效越高，而且当粒径小到亚2微米左右时，线速度的提高，其分离度就不再降低，从而改变了许久以来人们不得不在 “速度和分离度之间取舍”的局面。

　　57、关于配置流动相，有机相我们可以甲醇乙腈同时用，这个是基于什么考虑的?是不是根据甲醇乙腈选择性不同、样品在这个两者的溶解度的差异以及调节洗流动相脱能力来考虑的?

　　答：甲醇和乙腈同时用，可以获得单纯的甲醇或者乙腈不一样的选择性，而且洗脱能力也会改变，根据多元流动相的强度因素Sab.....=Saψa+Sbψb=...Sa和Sb纯溶剂a和b的溶剂强度因素;ψa、ψb分别为a和b的体积分数，所以在药典中有很多体系都使用甲醇乙腈体系;

　　58、三乙胺磷酸盐缓冲液作流动相，柱压一天比一天高，该怎么样解决?

　　答：把柱子再生下，再生的方法搜一下有很多反冲对绝大部分色谱柱都是可行的,效果不错。

　　59、新出厂液相色谱柱，保护溶剂一般是什么?怎样进行平衡清洗比较好，一般要平衡多长时间比较好?

　　答：柱子类型不同，保存溶剂也会不一样吧，具体要看说明书的说明。对于反相柱，一般用甲醇(乙腈)保存，也有用80%左右甲醇浓度的甲醇/水保存的。一般用流动相平衡冲洗10-20个柱体积即可(注意：柱体积不等于空柱管体积，4.6x250mm的色谱柱空柱管体积是4.15ml，而柱体积只有约2.5ml)。

　　60、据说液相色谱柱柱压达到一定高度就不能使用了，请问一般达到多高，用甲醇和乙腈是不是不一样?

　　答：柱压不是色谱柱不能使用的唯一因素，分离度才是最重要的。柱压只要没高到仪器不能承受的地步，例如超过300bar，就可以一直使用。甲醇的粘度比乙腈高，同样状况的柱子，如果用甲醇做流动相，柱压可能超了，换用乙腈会使柱压下降不少，仪器还能承受。不过尽管柱压还没上升到接近400Bar的限定，如果发现柱压上升速度较快，也需要及早对柱子进行清洗维护，从根本上排除导致柱压上升的源头。

　　61、柱塞板可不可拆下用超声波清洗，会有什么不良后果?

　　答：不建议将柱筛板拆下清洗，因为拆下承压的柱筛板会导致柱床发生变化，影响色谱性能。应该对污染的色谱柱先进行清洗维护，维护没有效果，再把拆洗柱筛板作为最后的手段。

　　62、一般正常使用一个C18柱能用多长时间?

　　答：柱寿命一般不按时间计算，按持续进样针数比较科学。一般正常使用维护，不超过pH和温度等范围，C18柱能达到500-2000针进样的寿命，视样品干净程度的不同而不同。

　　63、超高压快速高分离度色谱柱是不是未来液相色谱柱普及应用的一个发展趋势?

　　答：这是个大话题，今后使用会越来越多是肯定的，但是否会替代普通压力的液相还有争议。超高压也有使用上的不便，譬如容易堵，对设备硬件要求高等。有机会我再谈谈超高压液相色谱方面详细的一些情况。月旭公司作为专业的色谱柱生产商，今年也会推出自有品牌的超高压液相色谱柱，以满足不断增多的客户需要。

　　64、如果液相色谱谱图基线漂移很大是不是柱子的问题?波长越小的越大，270nm的还不怎么能看出来，230nm的就非常厉害了，有可能是什么原因造成的?

　　答：有可能是你的流动相的问题，230可能已经快到你流动相的截止波长了，当然紫外吸收强，基线漂移厉害。

　　65、我们有一台waters1525色谱仪，最近基线总是呈现波浪形很有规律，波长越小越明显，梯度洗脱时向上飘逸而且后一段时间呈现波浪形，很影响分析，我想问一下，是不是柱子的原因，用的是C18上海安普的?

　　答：应该是流动相组成变引起吸收本底变化造成的，特别是在波长小的时候，乙腈的截止波长低于200nm，但甲醇和水相对比较高，在低波长时，甲醇和水有一定的本底吸收。梯度进行时，随着不同本底的组分含量的变化，基线也会有相应的波动。

　　66、我是做农药残留分析的，用的是UV2487检测器，想问一下，C18色谱柱用什么缓冲液比较好，我以前做三聚氰胺是用柠檬酸，辛烷磺酸钠，也用农药检测行不行?还有用HLB柱能不能去除蔬菜和水果中的杂质?

　　答：C18色谱柱用用磷酸盐，醋酸盐就比较好啊，离子对试剂不是个好东东，你要慎用。我们做三聚氰胺用三氯乙酸。

　　67、液相色谱柱一般使用寿命多长?不同类型的色谱柱是否寿命也不一样?液相色谱柱与气相的柱子有何区别呢?

　　答：液相色谱柱一般使用寿命多长!我有一根柱子，用了大约1年半左右，发现同样浓度的样品它的峰展宽了。说明柱效下降。但是不影响结果。因为峰面积还是接近。所以做色谱之前先做下柱子性能测试。第一次的图谱要保留。

　　测试C18 RP柱，一般用到萘作为柱子的柱效判断。一般是18000片，对称性(usp)0.95-1.05间。

　　液相色谱柱与气相的柱子有何区别呢?

　　HPLC 是走液体的。分正相，反相。反相为例。Si 接着C18(键和相),电镜下看起来像绒毛一样的。所以一般用甲醇，乙腈保护RP柱。这样它的绒毛呈舒展状。GC 走气体的。固定相涂布固定液。

　　68、1.“水相”指的是什么?纯水?2.我们实验室的CN基柱保存在40%的乙腈里面，这个有不良后果吗?

　　答：水相就是纯水。CN基不适合保存在中等极性的溶剂中，除了可以低温保存在极性较大的纯水中外，还有可以保存在非极性溶剂如正己烷中。40%乙腈水，属于中等极性溶剂，短期过夜保存可能问题不大，长期保存不太好，后果就是可能会发生柱床坍塌。

　　69、CN基柱应该怎样维护才好呢?比如做完实验用什么流动相冲柱子、短期用什么溶剂保存、长期用什么溶剂保存等等。

　　答：CN可作正相柱，也可作反相柱用，除了保存溶剂有特殊要求外，其它维护办法和一般正相和反相柱没有多大区别。

　　70、月旭公司的液相色谱柱接头是大众的还是有自己的规格，我们是waters的分析仪，有月旭的产品可不可以?

　　答：月旭公司的色谱柱柱头的规格是大众的，因为我们也不自己生产柱管和柱头，月旭的柱管柱头供货商也是和一些Waters、Agient和Phenomenex一样的，也许是同一家。月旭柱头规格标配是Valco型，但也可以按照客户要求提供Parker型和Waters型。

　　你用Waters的仪器，而开始也用的是Waters柱子，如果是用不锈钢接头，匝扣的位置就固定了。如果用月旭的柱子，可以把固定匝扣位置的那段剪掉，换一个新的匝扣就可以重新固定匝扣位置。当然如果你已换成PEEK接头，问题就不会很大。

未完待续......

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