摘 要

　　杂质研究及控制是药品安全保证的关键要素之一, 是药品研发中风险控制意识的重要体现,药品临床使用中的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外, 有时还与药品中的杂质有关, 须严格控制。文中结合《化学药物杂质研究技术指导原则》相关内容, 探讨了杂质限度确定的一般原则。词源诠释“杂质”是指物质中所夹杂的其他成分。《化学药物杂质研究技术指导原则》定义药物杂质为任何影响药物纯度的物质。杂质研究的对象是与药物具渊源关系的物质,如生产工艺、起始原料、药物降解等因素而存在于药物中的其他物质,对于正常情况下本不应存在的生产中产品间的交叉污染、外源性污染物(如灰尘等)、人为加入的毒物等虽然具有较大安全性隐患,但不属于杂质研究范畴,而是通过GMP等管理措施予以控制。药品临床使用中的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外,有时还与药品中的杂质有关,须严格控制。如葡萄糖输液中的5-羟甲基糠醛对人体横纹肌和内脏有损害;普罗布考中微量杂质会导致严重的眼毒性,USP31版中其杂质A、B、C限量分别为不得过0.0005%,0.02%和0.5%。因此杂质研究及控制是药品安全保证的关键要素,是药品研发中风险控制意识的重要体现。

　　从杂质来可能而且一般也没有必要,在不影响药物疗效和不发生与杂质相关的毒副反应前提下,通过系统全面的研究,将杂质控制在安全合理的范围内正是杂质研究的最终目的,这一允许的范围称为杂质限度。确定杂质限度的基本原则是AsLowAsReasonablePracticable(ALARP),考虑要素包括:

　　①杂质的活性或毒性,这是评估杂质可接受水平的核心要素,限度确定的首要依据,其他考虑因素均不可背离其安全性要求。

　　②生产工艺,大生产中的正常波动和制备工艺耐用性反映出的产品质量批内一致性和批间重复性。

　　③分析方法,能达到的检测水平和可接受的误差和精密度。

　　④稳定性,产品储运过程中控制降解的方法和措施,以及在拟定贮藏条件下能够使产品保持其规定质量指标的有效期。即对药物中杂质的控制及其限度制订的考虑应包括非临床安全性和临床研究用样品的杂质概况,工艺稳定的具有一定代表性批次大生产产品的杂质概况汇总和分析。当杂质有特殊的药理活性或毒性时,须作为特定杂质严格控制。大生产的可行性及检测方法分析能力应与安全性数据所能支持的杂质水平相匹配,否则,需优化工艺、改进分析方法;如果安全性数据所能支持的杂质水平远宽松于大生产的可行性及检测能力,尚需结合药品注册中CMC的一般技术要求、指导原则中质控限度要求以及GMP要求等相关考虑,将杂质限度控制在较严格的水平。

　　由此可见,杂质研究涉及杂质分析方法的建立与验证、杂质确认、杂质限度的确定及杂质控制诸方面。即结合杂质的不同特点对分析方法进行系统研究和验证,使建立的分析方法适合于相应检测的要求;通过对特定杂质与非特定杂质的确认、毒性(生物活性)杂质与一般杂质的确认和杂质谱分析等研究工作,为杂质控制及限度确定提供依据;在综合杂质的特性、可接受水平、大生产能达到的水平基础上源看,完全除去药品中的杂质几乎不制订安全合理的限度;根据杂质研究结果,通过原辅料的源头控制、制备工艺的过程控制、稳定性控制(贮藏条件、有效期确定)等措施使杂质控制在安全合理范围。

　　分析方法的选择与研究

　　分析方法是获取杂质信息的手段,直接关系到对药物杂质把握的准确性,因此,杂质研究的首要问题是选择合适的分析方法。杂质检测的实质是根据药物杂质的化学结构和特点,采用物理或化学等手段将杂质信号放大,易于辨认和定量。杂质的微量性和复杂性,使得检测方法的专属性和灵敏度十分关键。杂质检测方法选择和研究,需要从化合物结构特征、理化性质、剂型特征、工艺过程、标准要素等方面综合设计、严谨研究、规范验证。分析方法各有局限,需关注不同原理分析方法间的相互补充和验证。

　　1.1关注不同方法间的互补与验证

　　在杂质的检测和控制中,RPHPLC-VU组合曾经发挥了重要的作用,一度被认为是一种理想的检测手段,在杂质研究中普遍采用,但随着杂质研究的不断深入,该方法的局限性逐步显现,对于杂质检测来讲,其致命弱点就是得到的色谱图不一定能真实反映实际情况,有时出现杂质漏检。原因是:①极性比目标物大得多的化合物可能被掩盖(与溶剂峰重叠);极性比目标物小得多的化合物难以被洗脱,甚至保留在色谱柱上。②通常只用一个检测波长,无紫外吸收或在检测波长处吸收相差较大的多种化合物,有时在某一检测波长处不能被有效检出。

　　药物中杂质情况的复杂性凸显了检测波长选择的重要性,失当的检测波长可误导杂质研究的结果。图1A是某注射液稳定性考察中286nm检测有关物质的色谱图,图1B为同一样品改用230nm检测的色谱图,显示此时主药已降解殆尽,原286nm检测到的主峰并非主成分,事实上该主药并不适于制成注射液。

　　检测波长应根据检查对象产品中杂质的吸收情况确定,兼顾各杂质的吸收情况,或在特定波长下检测特定杂质,而不能仅仅考虑主药的UV吸收特性。对于已知杂质,可根据其UV吸收情况,选择各杂质均有较大吸收的波长;对于非特定杂质(未知杂质)可根据强制降解试验中DAD检测情况或比较几种不同检测波长处色谱峰的数量和大小等综合考虑确定检测波长。如产品包含无紫外吸收的杂质,可改用其他类型检测器,流动相许可时,蒸发光散射检测器可能更好,其灵敏度高于示差折光检测器,在无(弱)紫外吸收的杂质控制方面得到较好应用,可积极研究,必要时采用。ECD检测器对于无紫外吸收的杂质控制在灵敏度方面更具优势,如阿奇霉素相关物质的控制在USP30中在原UV-HPLC方法基础上增加ECD-HPLC方法,并作为检测结果的仲裁方法。

　　由于各种分析方法均具有一定的局限性,在杂质研究中,应注意不同原理的分析方法间的相互补充与验证,如HPLC与TLC的互相补充,反相HPLC系统与正相HPLC系统的相互补充,HPLC不同检测器的相互补充等。事实上,药物杂质的物质多样性决定了有时以现有技术难以使用一种检测手段同时检测所有杂质,如硝呋太尔的杂质检查中,采用TLC法检测无紫外吸收且极性过大的杂质3-氨基-5(甲硫基)甲基-2-唑烷酮硫酸盐,用HPLC法检测其他杂质。

　　1.2关注不同杂质色谱行为的差异,重视梯度洗脱法在杂质检出和方法学验证中的重要性

　　梯度洗脱法可以通过调节不同分析时间流动相组成,在较短时间内有效检出极性相差悬殊的系列物质。药物杂质情况通常比较复杂,既有工艺和原料引入的杂质和中间体,也可能包含各种因素的降解物、缩合物等共存物质,通常都是未知物,其极性、油/水分配特性有时相差较大,等度洗脱法难以在较短时间完全洗脱所有杂质,梯度洗脱往往可取得良好效果,图2是某产品中几种杂质对照品混合溶液等度洗脱和梯度洗脱检出效果对比,可见,合适的梯度洗脱法不仅可以优化各物质的保留时间,较短时间内全部洗脱各种杂质,同时,还可以改善峰形,提高检测灵敏度。在国外的杂质研究中广为应用,呈现出逐步取代等度洗脱的趋势。与等度洗脱法相比,梯度法操作复杂,并可引起色谱基线漂移,影响结果精密度,因此,如果等度洗脱可以有效检出相关杂质,可作为首先考虑,但方法学验证中,梯度洗脱法在验证等度法是否可有效检出所有相关杂质时具有重要意义。

　　1.3修订原研厂方法,需慎重思考、全面调研

　　一般来讲,原研厂对药物杂质经过了比较系统深入的研究,针对杂质的具体特点,有时采用不常用的色谱填料或组成复杂的流动相系统,或方法的分析时间较长,有时规定了最难分离物质对分离度要求以保证方法的分离度等措施,来确保有关杂质的有效检出,在仿制研究时,需要理性分析原研厂分析方法的这些“缺憾”,谨慎思考新建方法的“优势”,规范进行方法改变前后分析结果的可比性研究。如图3为某药品有关物质在原研厂色谱柱与通用型C18柱上色谱峰对比,表明有时分析方法具备了普及性,却不能有效检出相关杂质。

　　杂质谱分析与杂质确认

　　杂质谱包括药物中所有杂质的种类(研究初期可为色谱保留值等IP信息)、含量、来源及结构等信息。通过杂质谱分析较为全面地掌握产品中杂质概貌(包括来源和结构);有针对性地选择合适的分析方法,以确保杂质的有效检出和确认;跟踪杂质谱对安全性试验或临床试验结果产生的影响,评估杂质的可接受水平;结合规模化生产时杂质谱的变化,评估杂质安全性风险,确立安全的杂质控制水平。

　　从制备工艺和产品结构分析入手,评估、预测产品中可能存在的副产物、中间体、降解物以及试剂、催化剂等大体的杂质概况,考证建立的分析方法是否能够将它们逐一检出,并进行相应的验证工作,是杂质研究的主动思维,而传统的被动行为仅从建立的一种检测方法所检出的有关物质归属其来源情况,容易出现杂质漏检的情况,难以全面掌握杂质谱。如,杂质谱分析表明抗禽流感药物磷酸奥司他韦所采用的合成路线会产生具有遗传毒性的双叠氮杂质RO64-1637,经有针对性的分析考查,的确在产品中检测到该杂质,尽管其含量极低,考虑到其毒性情况,质量标准中仍作为特殊杂质予以严格控制(不得大于100ppm),保证了其临床应用的安全性。因此杂质谱分析对于合理确定杂质限度、降低杂质安全性风险具有重要意义。

　　对比研究是桥接上市药物安全有效性信息的基础,获取上市产品杂质信息的重要途径,通过“类比思维”可以减少研发工作的疏漏和复杂性。对比研究已成为仿制药研发的重要手段,但目前多数注册申请人仅进行了杂质总量的对比,未进行杂质种类、数量和含量的对比,药品某些不良反应的发生往往与某(些)特定杂质相关,仅仅关注总杂质是不够的。BP收载了克林霉素磷酸酯的5种杂质的化学结构,毒性相差几个数量级,国内产品生产工艺与原研厂不同(无菌灌装),多经过了剧烈的终端灭菌过程,而主药水溶液高温不稳定,杂质总量与原研厂产品相比同样较高,但具体为何种杂质,毒性如何,与原发厂产品杂质是否相同,未进行对比研究,无从桥接上市产品的安全性信息,未进行临床试验或动物安全性试验直接上市,其安全性风险是不堪设想的。

　　杂质对比研究研究时,除杂质色谱保留时间属性外,及时采纳分析科学的新技术,多属性把握其物质一致性非常必要,可以避免结构类似杂质仅通过保留时间确定其物质一致性产生的偏差。如采用LC-MSLC-DAD等手段通过杂质色谱行为、分子量、碎片信息、UV吸收特征等属性共同把握杂质一致性,以提高对比研究结果的准确性。

　　杂质限度确定的基本思路

　　创新药杂质限度的确定需要综合药学、药理毒理及临床研究结果综合判定,除用含有一定量杂质的样品进行毒理试验外,也可以直接采用该杂质进行相应的毒理试验,为杂质限度的确定提供安全性方面的依据,这对于含可能具有遗传毒性结构单元的杂质是必须的,通过体外点突变和染色体畸变试验进行安全性考查,如果出现阳性结果,需通过优化工艺过程,消除其生成,否则,需在质量标准中严格控制。如果某已知杂质的毒性在相关的文献上已有详细记载,也可作为杂质限度确定的依据之一。

　　通常情况下,确定杂质限度的思路包括如下过程:通盘考虑、综合设计,明晰拟进行动物安全性试验样品杂质谱※比较动物安全性试验用样品中特定杂质含量与临床最大剂量下该杂质的暴露量,确定该杂质的安全窗※根据动物安全性试验结果,控制临床研究样品的杂质谱※根据临床研究结果,确认样品可接受的杂质谱范围※考虑生产工艺与分析方法的正常波动、产品的稳定性,选择工艺相对成熟、多批次、批量接近工业化具有一定代表性的样品考查杂质情况※确定杂质限度(如:平均值+3×SD)。

　　国内研究单位普遍对此未给予足够重视,安全性试验及临床试验样品纯而又纯或根本不了解其杂质情况,导致上市产品的杂质情况缺乏充分的安全性验证与评估,安全性风险得不到有效控制。

　　仿制药的杂质研究是求证与上市产品物质基础是否“一致”的过程,可基于杂质对比研究、文献资料、安全性研究资料确定杂质限度。通过对比研究,如果产品中的杂质种类与上市产品相同,含量不高于上市产品,一般可桥接上市产品的安全性,对于新出现杂质或超量杂质,需参照创新药研发思路。其他类别新药需要分析与其研发基础-上市产品的异同,相同之处,可桥接其安全性基础,不同之处,需分析这种不同和改变,对杂质安全性将产生何种影响,并进行相应研究,使产生的风险处于可控状态。

　　结语

　　综上可见,药品中的杂质是否能被全面准确地控制,直接关系到药品的质量可控与安全性。杂质研究应关注杂质检测方法的选择与验证,注意对研究过程中所有批次样品,包括安全性试验或临床试验样品、各种生产规模的样品中的杂质进行完整的记录,这些数据是制订杂质限度的重要依据。杂质限度的确定要综合考虑杂质的安全性、生产的可行性、合理性与产品的稳定性。仿制药品的杂质研究要注意与已上市产品进行质量对比研究,以求证与上市产品物质基础的一致性,充分保证产品的安全性。

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