针对目前国内化学药品复方制剂研究中存在有关物质研究方法的不规范和限度确定的不合理, 本文建议在复方制剂的有关物质研究中, 对各主成分的有关物质进行分别研究和控制, 并对复方制剂中有关物质定性归属的几种研究方法进行了讨论。

　　关于化学药品复方制剂杂质来源归属研究的基本思路, 在之前的论著[ 1]中已经进行了讨论。国内的研发单位在进行化药复方制剂类品种的研究过程中, 有关物质的研究很不规范, 在该类品种的技术审评中我们也注意到, 多数化药复方制剂药学方面的发补也多是由于有关物质研究方法的不规范和限度的不合理造成, 导致注册申请的延误。由于化学药物复方制剂在国内药品注册申请中占有相当比例,因此有必要对该类制剂有关物质定性归属的研究方法进行阐述, 希望能引起研发者的重视。

　　目前存在的主要问题

　　化学药品复方制剂的有关物质研究, 目前方法多采用HPLC法, 但在方法学研究上尚不深入, 研究者常采用复方中某一主成分单方制剂中有关物质控制所用的色谱条件或仅进行微小调整, 将几种主成分进行简单分离后, 然后采用面积归一化法或自身对照法, 以各主成分的峰面积之和(或某一主成分的峰面积)作为对照, 计算单个杂质和总杂质的量,限度往往定为总杂质或单个杂质不得超过X%, 总杂质不得超过Y%。不针对处方中各主成分的有关物质进行分别研究和分别控制, 限度的确定没有依据, 可能存在较大的安全性隐患。

　　问题分析

　　由于历史的原因, 目前国内不少单方制剂的有关物质限度多采用自身对照法, 仅限定单个杂质和总杂质。这种质控方法尽管与ICH的要求[ 2 -3] 还有差距, 但对相对控制药品的质量和保证药品的安全有效也起到了积极的作用。然而, 这种方法对于控制复方制剂中的有关物质则可能存在很大的风险。

　　由于复方制剂中几种主成分的量往往差别很大, 或者紫外响应值不同, 表现在HPLC图谱中, 几种主成分常常有几倍甚至几十倍的积分面积差别。这时, 对于图谱中积分面积较小的主成分, 其有关物质在计算时往往会被忽略, 即使其有关物质的量与其单方制剂相比已经高很多时, 总有关物质的量仍然符合申报的限度要求。这时, 该主成分的有关物质就可能会产生安全性问题。

　　例如:某抗高血压药物A中存在一个毒性较大的已知杂质A1 , A单方片剂的国外药典标准中明确规定有关物质限度为:已知杂质A1 按自身对照法计算, 不得过0.3%, 其他单个未知杂质不得过0.5%,总杂质不得过1.0%。现国内研究单位开发了某创新性复方制剂, 将A与某降脂药B组成复方片。由于该复方中2种药物的含量差别较大, 紫外响应也不同, 从提供的HPLC图谱中可以看出, 主成分B的HPLC积分面积为A的25 倍左右。研究单位在进行有关物质计算时, 取供试品溶液的1%作为对照溶液, 以对照溶液中2种主成分A和B的峰面积之和作为对照, 对HPLC图谱中出现的各个有关物质进行计算。申报的标准中限度定为:单个杂质不得过0.5%, 总杂质不得过1.0%, 按申报的方法进行计算, 3 批样品的测定值为:已知杂质A1 的量皆小于0.15%, 其他单个未知杂质皆在0.2% ～ 0.32%,总杂质在0.45% ～ 0.58%。按这种方法计算看似有关物质的实测值很小, 但审评时我们发现, 由于2种主成分的相容性问题, 主成分A的稳定性较差,制成复方制剂后已知杂质A1 有明显增加, 按A单方片的计算方法进行计算, 复方制剂中A1 的量已经达到2.8% ～ 3.4%, 达到了原单方片的限度10倍左右, 但按自拟标准的计算方法计算却只有0.11% ～ 0.13%, 不能反映出有关物质的真实情况,计算方法明显不合理。而由于存在相容性问题, 本品组分的合理性也有待进一步商榷。该复方制剂中的有关物质情况见表1。

　　针对上述问题, 我们建议在复方制剂的有关物质研究中, 对各主成分的有关物质进行分别研究和分别控制, 即经归属研究后, 将复方制剂HPLC图谱中出现的全部有关物质逐一甄别归属为各主成分的有关物质, 然后针对各主成分分别计算有关物质, 在标准中像单方片一样对各主成分的有关物质进行分别控制, 避免“一锅粥”式的研究和质控方式。

　　定性归属方法

　　对各主成分进行分别控制的基础是:必须首先将各有关物质分别甄别归属于各个主成分。对于该类归属研究, 很多研发人员认为有一定难度, 进行的研究很不深入。事实上, 由于有关物质与主成分一般皆存在渊源关系, 因而仅进行归属研究并非难事。归属的方法可以有多种, 较常使用的有HPLC峰保留时间对比法和HPLC-MS联用方法等。

　　3.1HPLC峰保留时间对比法

　　峰保留时间对比法是采用HPLC法, 在相同的色谱条件下分别测定复方制剂以及处方中各个单一主成分(原料药或相同辅料的单方片)的HPLC图谱, 经对比研究后将各个有关物质归属为不同的主成分, 在质量标准中采用相对保留时间(RRT)将各杂质归属为不同的主成分, 然后分别进行控制。HPLC峰保留时间对比法具有方便、快捷的优点, 是复方制剂有关物质研究的常用方法, 但该方法对于控制制成复方制剂后新增加的有关物质则较为困难, 需要结合LC-MS等其他方法进行研究后确定。不过, 我们仍然可以在质量标准中采用相对保留时间来表征各有关物质的归属情况。

　　3.2HPLC-MS联用法

　　HPLC-MS联用法[ 5] 是对复方制剂中的有关物质进行定性归属研究最为有效的方法之一。该方法可以采用液质联用仪对复方制剂HPLC图谱中出现的各个主要色谱峰分别进行质谱分析, 获得各主要有关物质的一级质谱图和二级质谱图, 根据各有关物质的分子离子峰及裂解后产生的碎片离子峰的信息进行初步的质谱分析, 从而推测有关物质是由哪种主成分产生的。由于主成分与其相应的有关物质一般皆具有渊源关系, 可利用质谱中出现的一些特征信息进行归属。通常我们可以根据有关物质的分子离子峰、特征官能团和特征元素进行归属。

　　3.2.1根据有关物质的分子离子峰

　　组成复方制剂中的各主成分往往为上市多年的品种, 研发者一般已经对各主成分中的各种有关物质有了一定的了解, 或经过分析主成分的合成工艺和结构特点获得有关物质的可能结构, 然后在一级质谱上根据各有关物质的分子离子峰初步推断归属为某主成分的有关物质[ 5 -6] 。

　　3.2.2根据特征官能团的特征峰

　　在质谱图中, 主成分及其有关物质往往会出现一系列相似的特征碎片离子峰, 可根据这些特征峰的情况进行归属。比如:主成分中如果含有苯磺酰基、氯/氟代苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、四氮唑等基团, 则其工艺杂质和降解产物的二级质谱中一般也会出现这些基团的特征峰[ 6] , 经与主成分的质谱图进行简单对比即可进行甄别归属。在多数情况下, 我们无需确定该有关物质的结构即可将其归属为某一主成分的有关物质。例如:苯磺酰基为较为稳定的结构, 如果某化合物结构中含有苯磺酰基, 则其二级质谱图中一般都会出现m/e142的特征裂解峰。如果复方制剂中的某一主成分含苯磺酰基结构, 则二级质谱图中出现m/e142峰的有关物质即可初步确定为该主成分的有关物质。

　　3.2.3根据特征元素产生的特征峰

　　某些元素在质谱中会产生很强的特征峰, 可以有效帮助我们确定有关物质的归属。例如:溴代产物在质谱中会出现溴的特征质谱峰[ 6] (m/e相差2、丰度相当的双峰), 如果复方制剂中的某主成分结构中存在溴代基团, 则其有关物质的质谱图中也多会出现溴的特征峰, 对于归属研究具有很好的提示作用。

　　总结

　　以上为我们对复方制剂中有关物质定性归属的研究方法的几点认识。需要说明的是, 定性归属仅仅是复方制剂有关物质研究的第一步, 在完成归属后仍然需要进行一系列的方法学研究才能最终确定方法。而且目前这种方法仅是对复方中各主成分的有关物质进行分别归属和控制, 随着我们对有关物质研究的不断深入, 对有关物质控制的要求不断提高, 对复方制剂中出现的每个有关物质分别进行结构鉴定和分别控制也必然成为将来复方制剂有关物质研究的趋势。

　　张震, 张玉琥 国家食品药品监督管理局药品审评中心

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