药品在临床使用中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大关系。为保证临床用药的安全性，需要严格控制药品中的杂质。无论是创新性药物还是仿制药，杂质研究都是药物研发中的一项重要内容。

　　按照杂质的理化性质，药品中的杂质可以分为有机杂质、无机杂质和残留溶剂三种类型。其中，无机杂质和残留溶剂主要来源于生产过程，结构和毒性一般是已知的，其检查方法和限度要求在药典、指导原则中多有收载，且具有一定的通用性，故研究相对简单。有机杂质来源于原料药和制剂的生产过程或贮存过程，化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系，通常又称之为有关物质。有关物质具有个性化的特征，不同的药品具有不同的杂质谱，同一药品用不同工艺生产也可能具有不同的杂质谱，且杂质的结构、理化性质和毒性情况复杂，因此有关物质检查研究常常是药品研发中的难点之一。尽管国内外有关杂质研究的技术指导原则中对有关物质检查研究的一般原则和要求有比较详细的阐述，但由于有关物质研究的复杂性，从提交的药品注册申报资料来看，和有关物质相关的问题仍较为突出。

　　有关物质检查研究的主要内容包括分析方法的建立与验证、杂质限度的确定。本文将针对这两方面的内容，讨论有关物质的研究要求，并指出申报资料中需要注意的几个问题。

　　1、分析方法的建立与验证

　　有关物质研究的首要问题是建立合适的分离和检测方法。有关物质的检查方法包括化学法、光谱法和色谱法等，其中色谱法最为常用。通常，可基于原料药的合成工艺初步分析药品中可能存在的工艺杂质，同时基于主药的结构分析其可能的降解途径及降解产物，在此基础上根据主药及杂质的理化性质、化学结构及杂质的控制要求等考虑选用合适的检查方法，例如HPLC、TLC、GC 或CE 等。

　　分析方法的建立包括分离检测条件的筛选和优化、方法的验证两个方面的研究工作。以有关物质检查最为常用的HPLC-UV 方法为例，在方法的筛选和优化研究中需要完成三部分的工作，即确定分离和检测条件、确定待测样品的制备方法以及杂质的定量方法。其中，分离和检测条件关系检查方法的专属性和灵敏度，是方法建立过程中最为重要也最为复杂的研究内容。一般而言，分离和检测条件的确定包括以下几个步骤：

　　⑴明确方法的检测目标并尽可能了解待测物质的理化性质，选择合适的含有潜在工艺杂质或降解产物的预测性样品(predictive sample)。例如原料药粗品、重结晶母液、破坏试验样品及已分离出的杂质等用于色谱条件的筛选。

　　⑵筛选固定相和流动相条件。通常是基于文献和经验、待测物质的理化性质，以及研究者对色谱柱、溶剂和缓冲液等性质的了解，选择初步的色谱柱、流动相，并采用选定的预测性样品对分离条件进行考察。重复这一筛选过程直至找到一个可以使各主要杂质及主药之间分离情况达到基本可接受水平的分离条件作为初始色谱条件。

　　⑶对初始色谱条件进行优化。设计一系列试验考察色谱参数，如有机相比例、pH、流速、柱温和检测波长等对杂质分离和检出的影响，并根据试验结果确定最优色谱参数。在优化研究过程中还可以观察到哪些参数对方法有显著影响，对这些参数应在方法验证研究的耐用性试验中予以考察。

　　一些仿制药品的有关物质检查方法在国内外药典中有收载或已有文献报道，上述过程可能会简化。但是，在无文献可以参考时，开发一个新方法的工作量会比较大，花费的时间也比较长。近年来，在有关物质检查方法的开发研究中应用了一些高效的方法开发策略，特别是计算机辅助的HPLC 色谱条件筛选方法发展很快，提高了筛选的效率。

　　在确定检查的色谱条件、分析样品的制备方法以及杂质的定量方法后，应按照相关技术指导原则的要求开展方法学验证工作( 中国药典2010年版二部附录172)。需要注意的是，方法验证工作是在检查方法确定后开展的，其目的是证明采用的方法适用于相应检测要求，检查方法的筛选优化研究不能代替方法的验证工作，尽管二者的部分研究内容有交叉。

　　在方法的建立和验证过程中，尚需要关注以下几个问题：

　　⑴采用HPLC-UV 法进行检查时，使用二极管阵列检测器有着重要意义，通过该检测器可获得各杂质的紫外光谱信息，有助于判断杂质检测波长选择的合理性，避免杂质的漏检，同时还可以进行峰纯度检查。

　　⑵优化的检测波长应是主要杂质的最大吸收，而不是主药的最大吸收，同时，应使主药和各主要杂质的响应差异最小。如果主药和各主要杂质的响应差异较大，例如超出了0.9 ～ 1.1 的范围时，在采用主成分自身对照法进行杂质定量时需要加校正因子。此外，如用UV 低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长。

　　⑶适度的破坏试验可用于考察分析方法对降解产物的检出能力，也可用于考察主药的降解途径和降解产物。但是，破坏试验的目的不是使活性化合物完全降解，而只是要产生少量的降解产物，通常在敏感条件下活性化合物降解10%～ 30%较为合适，过分降解将产生一些在生产和贮存条件下不可能生成的二级甚至三级降解产物，对色谱条件的筛选不利。在破坏试验中应关注物料平衡情况，但是由于降解产物和主药的响应可能存在差异或降解产物无法被检出、降解产物可能进一步降解以及存在多条降解途径等因素，物料不平衡的现象还是较为常见。

　　⑷在方法验证的耐用性试验中应对色谱系统的适用性进行考察，并通过耐用性评估，建立一系列的系统适用性参数( 例如分离度等)，以确保在任何时候使用该分析方法都是有效的。和方法优化研究中对色谱参数的考察不同，耐用性试验中各试验参数应在一个比较窄的范围内变化以模拟正常的日间变异。

　　2、杂质限度的确定

　　杂质控制的主要目的是将有害杂质控制在安全范围内以保证临床用药的安全性，次要目的是合理控制药品批间和有效期内杂质水平的波动以保证药品质量的均一性。因此，安全性决定药品中所能接受的杂质水平，是确定杂质限度的首要考虑因素。如果某杂质是主药在动物或人体中的主要代谢产物，则可不考虑其安全性。另外，对于具有基因毒性和致癌性的杂质，在确定限度时应予以特别关注。在符合安全性要求的前提下，确定杂质限度还要结合工艺的可行性和贮存的方便性考虑。

　　获取杂质安全性信息主要有3 种途径。第一，针对某杂质进行安全性研究直接获取安全性信息，研究用样品可以采用含有较高水平该杂质的原料药或制剂，也可以采用分离出的杂质单体;第二，通过和已上市产品进行杂质对比研究间接获取杂质的安全性信息;第三，通过检索文献获取某特定杂质的毒性数据。

　　对于大多数创新药，杂质安全性信息主要来源于整个研发过程中各项安全性研究结果，包括非临床毒理研究和临床研究。一般而言，在创新药开发过程中，按照毒理研究样品、临床研究样品和上市产品的顺序，其中的杂质含量应依次递减，毒理研究用样品中的杂质含量应该最高。上市产品杂质限度的确定要基于对整个研发过程中杂质数据的积累和分析，特别是临床前主要安全性研究、临床研究所用样品的杂质数据，以及规模化生产条件下产品的杂质数据。例如，某一创新药的日给药量为0.5 g，原料药杂质数据和拟定限度见表1。

　　基于表1 中的杂质数据对原料药拟定杂质限度的合理性分析如下：

　　对于杂质A，0.2%的拟定限度高于毒理和临床研究用批次的检测结果，也高于规模化生产批次的实测结果，限度依据不充分;按照杂质研究相关技术指导原则的要求，同时考虑到规模化生产批次杂质数据，降低到0.1%较为合理。

　　对于杂质B，0.2%的限度有毒理/ 临床研究批次的杂质数据支持，但和规模化生产批次的实测结果相比过紧;放宽到0.3%仍可以保证安全性，同时也可避免实际生产的杂质B 含量在0.2%～ 0.3%之间的产品被判为“ 不合格”。

　　对于杂质C，0.2%的限度有毒理/ 临床研究批次的杂质数据支持，也和规模化生产批次的实测结果相当，因此可认为是合理的。

　　对于杂质D，0.1%的限度高于毒理/ 临床研究批次、规模化生产批次的检测结果，但符合相关指导原则的要求，是可以接受的。

　　单个未知杂质0.1%的限度符合相关指导原则的规定。未知杂质总量(0.5% ) 和杂质总量(1.0% ) 分别与各种批次的杂质数据、单个杂质限度之和吻合，均是可以接受的。

　　对于仿制药( 包括仿制国内、外上市药品)，研制产品与已上市原研产品的杂质对比研究是论证杂质安全性和限度的较为简便的方法。另外，对于特定杂质的限度也可引用药典标准、文献进行论证。

　　但是，通过上述途径无法论证时，例如研制产品中含有已上市参照品中未含有的新杂质，且含量超过了相关技术指导原则规定的质控限度，则需要进行安全性研究以获取杂质的直接安全性数据。例如，某一仿制原料药( 最大日剂量为300 mg) 的杂质数据见表2。

　　表2 数据显示，仿制品和上市参照品的杂质谱不完全相同，包括杂质种类和主要杂质含量均有较大差别。仿制品中三个已知杂质(A、B、D) 的含量均高于上市品，且高于ICH 指导原则规定的界定阈值(qualifi cation threshold)0.15% [2]。其中，杂质B 本身为一上市药物，有长期人用历史，杂质D为主药在人体内产生的主要代谢产物，在制定限度时可以不考虑安全性问题。此外，仿制品中的两个未知杂质(RRT 1.28 和1.31) 也高于 0.15%。且缺乏试验和文献资料支持其安全性，需要进行必要的安全性研究。安全性研究(遗传毒性试验、重复给药毒性试验) 所用仿制品批次的杂质数据见表3。安全性研究结果支持所拟定的各杂质限度。

　　3、提交申报资料需要关注的问题

　　为帮助审评人员准确了解有关物质的研究和控制情况，国内注册的申报资料中应按照指导原则及其它相关规定的要求提供全面、详细的有关物质研究信息，需要关注以下问题：

　　⑴对原料药在合成、精制和贮存过程中实际或可能产生的杂质进行综述;对制剂生产和稳定性考察中观察到的降解产物进行综述，包括原料药与辅料或内包装材料、封闭物之间的反应产物。综述中应包括杂质的化学名称、结构式和来源分析( 例如合成起始原料、反应中间体、反应副产物和降解产物等)。

　　⑵对于新建的有关物质检查方法，应提供方法的研究报告，包括试验资料和支持性图谱，以清晰展示检查方法的建立和优化过程;采用药典、文献方法，如对试验参数进行了调整和优化，亦应提供调整前后的对比研究资料。同时，应根据分析方法的目的，提供完整的验证资料，注意根据耐用性试验结果建立合适的系统适用性要求。

　　⑶对于创新药，需要提供药品研制过程中所有批次样品( 包括用于安全性、临床研究的样品) 的杂质检测数据，并对整个研发过程中的不同规模样品的杂质情况进行比较，对差异进行讨论。对于仿制药以及已上市产品的改剂型产品，一般还要提供和已上市产品的有关物质对比检测数据。基于上述数据以及稳定性研究中杂质检查数据，详细论述各杂质限度确定的依据。

　　⑷对于药品中实际存在的、含量大于鉴定限度的杂质应说明结构研究情况，已鉴定结构的应提供结构研究资料，未能鉴定结构的亦应说明所开展的研究。如研究或质量标准中使用了杂质对照品，要提供杂质对照品的来源或制备工艺、结构确证、纯度标定和质量标准等资料。

　　⑸按照药品审评中心发布的《药品研究色谱数据工作站及色谱数据管理要求( 一)》附件1 的要求提供规范的支持性图谱，包括方法研究和验证的全部图谱、稳定性研究中的全部图谱及代表性批次的图谱。

　　4、结语

　　有关物质是影响药品安全性的因素之一，而有关物质检查研究是目前我国药品研发中的薄弱点之一。要全面提升我国药品研发的水平、切实保证公众用药的安全性，必须重视并加强有关物质的研究。

　　陈 震，国家食品药品监督管理局药品审评中心

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