反相色谱柱一般是由硅胶，有机/无机杂化硅胶或者聚合物作为基质， C18作为键合相。典型反相色谱柱基于分析物与烷烃链之间的疏水相互作用，根据样品组分的极性大小的差异而实现样品组分的分离。该分离模式有赖于色谱柱多孔基质内的C18键合相的自由伸展构象。

　　对于有机酸/碱类化合物，多羟基化合物以及偶氮类等极性化合物，由于含有羧基，氨基，羟基等可解离部分，其极性较大而不适合以经典反相C18类键合相进行分离。其典型表现为容量因子K过小，导致该类化合物在死时间附近出峰。

　　对于这些极性化合物，虽然我们可以在做梯度分析方法开发时，选择降低起始有机相的比例，甚至以纯水相作为起始流动相来增大该类化合物的容量因子。但化合物色谱峰峰形会出现峰展宽以及最严重的C18色谱柱固定相孔内去湿现象（Dewetting）；在停泵并重新恢复流速后，会出现化合物保留时间减少，色谱峰峰形异常（峰分叉、峰拖尾）等方法重现性问题，尤其以拖尾最为常见。

　　对于这些极性化合物该如何得到较好的保留，在这里且听小编慢慢道来。

　　一 孔内去湿现象（Dewetting）

　　反相HPLC一般以水作为弱洗脱相，以甲醇、乙腈等有机试剂作为强洗脱相。在运行梯度时，有机相的比例一般可在5%-100%范围内变化，以适应不同样品的分离需求。对于极性化合物来说，在典型的C18色谱柱上，即使有机相比例为5%亦不能够做到有效保留。在进一步降低有机相比例（以至为零），就会引起色谱柱多孔内表面以及固定键合相的去湿现象（Dewetting）。

图1 反相C18键合相上孔内去湿现象

　　如图1A所示，5%及其以上有机相时，流动相可轻易浸入固定相基质多孔内，浸湿内表面以及C18烷烃链，且C18链呈自由伸展构象，可很好的与样品组分的疏水部分发生相互作用实现适当的保留。当使用100%水相的时候，如图1B，虽然可以选择增大色谱柱前段压力的方式，使得纯水相浸入基质多孔内部，却无法实现对内表面以及C18链的有效浸湿，此外由于色谱柱沿流动相流动方向上的压力降现象（如图2），使得整个色谱柱的浸湿状态存在很大差异。当柱前压减小时（如停泵），由于多孔内部的强疏水性，纯水相则被“排出”孔隙，导致去湿现象发生，如图1C所示。

图2 反相色谱柱压力降

　　C18链在孔内去湿现象发生前后，在多孔内的构象如下图3所示。在典型反相HPLC流动相下（水相≤95%），C18链在多孔内呈现自由伸展构象；在100%水相下， C18链则相互之间“交联”并最大程度的靠近内表面，形成疏水屏蔽层，失去与待分离组分疏水部分相互作用的能力，导致保留时间变短。

图3 C18链在孔内去湿现象发生前后

　　二 极性化合物分离挑战

　　以典型的反相C18色谱柱对极性化合物进行分离时，往往会出现保留时间过短，色谱峰峰形拖尾问题。保留时间过短往往是由于化合物本身或者在体系中解离之后极性过大，油-水分配系数过小而不能与疏水选择性基团发生足够的疏水相互作用，进而随起始流动相一起直接流出色谱柱。

　　如有机酸类化合物在流动相pH大于其pKa时发生解离而本身带负电，可与硅胶基质上残留的金属离子发生静电相互作用；有机碱类化合物在流动相pH小于其pKa时发生解离而本身带正电，与弱酸性的硅羟基产生静电相互作用；多羟基，羟基-胺类有机化合物以及未解离有机酸碱类化合物与硅羟基之间的氢键相互作用。以上三种“二级保留”相互作用，均会造成有机极性化合物的拖尾。此外，溶解极性化合物的溶剂选择不合适的话，也会导致色谱峰拖尾现象。典型极性化合物如下图4所示。

图4 极性化合物

　　因此，极性化合物在反相色谱柱上做分析方法开发时主要面临以下几方面的问题：

　　（1）如何使得极性化合物具有适当的保留时间；

　　（2）如何避免在使用高水比例甚至纯水相洗脱时出现的孔内去湿（相塌陷）问题；

　　（3）如何最大可能地减小色谱峰拖尾因子，获得优异的峰形；

　　三 极性化合物分离策略

　　利用纯水相洗脱方式对极性化合物进行分离，面临色谱柱固定相孔内去湿（相塌陷）问题，但可通过对经典反相C18键合相进行改性，或者使用其他键合相以及使用Hilic分离模式，最大程度地减小或避免该现象的发生，同时做到对极性化合物有效保留。

　　色谱柱孔内去湿现象的发生以及程度的大小与色谱填料颗粒孔径的大小，多孔内表面键合相的键合密度，所用烷烃链长度、基质表面裸露的硅羟基数量以及封端类型有关。

　　3.1 非封端短链烷烃键合固定相

　　这种类型的反相色谱柱主要特点有两个:硅胶基质表面裸露的硅羟基不封端以及键合固定相链长度小于C8。由于固定相烷烃链长度远小于C18，多孔内疏水性变小，加之表面硅羟基不封端使得纯水相与多孔接触角变小，与典型C18相比，发生孔内去湿现象的可能性大大减小。与此同时，该种类型的色谱柱由于键合烷烃链长度较小，在对样品组分分离的时候，吸附作用以及硅羟基氢键相互作用占主要地位。

　　3.2 极性封端与极性增强型固定相

　　该型色谱柱采用极性或者亲水性的封端试剂对表面裸露的硅羟基进行封端，C18的键合密度较低，这种改性方式与典型的C18色谱柱相比，增大了内表面的水浸润性且较低的键合密度也使得孔内疏水性相对减小，因而允许使用100%水相。

　　3.3 极性内嵌烷基固定相

　　这种类型的色谱柱在长链烷基靠近硅胶内表面的一端，内嵌入甲酸酯基类、脲或者酰胺基以及硫酰胺基等极性改性官能团。由于极性内嵌，使得整个键合相的亲水性增强，多孔内疏水性减小，在100%水相条件下，极性内嵌烷烃链依然保持自由伸展构象。此外，内嵌极性基团对表面裸露的硅羟基亦有一定的屏蔽作用，减小了极性化合物特别是碱性化合物的拖尾因子，色谱峰峰形更加对称。

　　典型反相HPLC色谱柱在使用100%水相对极性化合物进行分离分析时，易出现硅胶多孔内去湿（相塌陷）现象，导致化合物保留时间减小，方法重现性出现问题。通过对色谱柱硅胶表面或者烷烃链改性，如增加内表面极性大小以及烷烃链内嵌极性官能团，使得多孔内表面及固定相被水浸润能力增加，而减少或避免孔内去湿现象的发生。此外，也可通过调整HPLC操作方式以及改变色谱条件，对极性化合物的保留因子以及峰形进行调整。

　　内容来源：月旭科技

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