4月，药研江湖参加了第九届仿制药峰会，有幸对知名分析专家肖柏明老师进行了采访。
肖柏明老师主要针对以下三方面进行了分享：
(1)反向工程中常规性的研究有哪些?分析人员在反向工程中的价值和参与形式。
(2)分析方法转移时的注意事项。
(3)实际项目案例分析。
由于内容较多，以上内容将分为三部分在公众号发布,请大家关注。
左：肖柏明老师 右：铭研医药CEO何小炳先生
肖柏明博士，南京柏贤医药总经理，先声药业前执行技术总监。美国西东大学(新泽西州)化学博士和MBA学位。
加入先声之前，他有着12年的制药研发的工作经历，先后在美国的百时美施贵宝、强生从事分析和项目管理工作。肖博士是分析研发的专家，他对于各种各样法规性文件有着逻辑性认识和综合性知识。
2010年加入先声起至今，肖博士在创新药和仿制药开发中担任更多重要的职务。他领导先声-百时美施贵宝合作项目如BMS-817378，CETP以及Orencia。肖博士受邀就分离理论和实践，分析方法论，和杂质谱雅安就的系统化方法做过许多学术演讲。
Q 药研江湖
老师您好！很荣幸能有机会向您学习。第一个问题是关于反向工程的。现在反向工程越来越受到大家的重视，并且CDE也要求企业在研究资料中增加反向工程的研究内容。
然而，在大部分研发人员的思想中，觉得反向工程是制剂部门的工作。我个人觉得，这其实应该是制剂和分析两个部门共同协作的结果。导致这种思维的原因是，我认为是大多数厂家并不知道反向工程具体包含哪些研究。
所以，我想请老师给我们一个方向，在反向工程的研究中，常规性的研究有哪些?另外，关于反向工程中一些研究方法，其结果的可靠性的保证，有没有什么资料或文献我们可以学习的?
A 肖柏明老师
首先，我必须声明自己是已经长期离开研发一线的人, 只是靠着一种情怀和追求才算能勉强跟上时代的变迁。必须坦率地讲我回答不出您这个问题。
过去在美国的大公司从事的创新药的研究，所以您这个问题算是点到了我的软肋，我并无直接做反向工程研究的经验。但我认为做分析的人应当要参与反向工程的研究，因为这样可以弥补制剂人员在分析技术上的不足之处。
分析人员的参与是非常有必要的，这样可以增加分析实验设计和数据的可靠性。
反向工程中一项重要的工作就是辅料的检测。
首先要梳理研究对象属于哪一类物质，它的挥发性、溶解性、稳定性、反应活性和基质影响等因素决定了用什么样的分析方法和检测手段，然后通过参考文献的学习和总结，找到如何去做自研的大概思路。这样做比试错法往往会起到事半功倍的效果。
通过一些现代的分析技术和仪器，比如CAD检测器就是一个非常好的通用的检测手段。它不但可以检测大多数具有UV吸收的物质，比如API，也可以同时检测很多辅料。
另外一些形成的盐、反离子酸或碱、金属离子，也可以用CAD检测器检测出来。作为分析人员，积极主动地参与研发，并及时提供准确的分析数据是责无旁贷的职责。分析工作的效率，在很大程度上取决于分析方法。因此要求分析方法应当具有高度的专属性、精密度、和耐用性。对于有关物质方法，还需要有足够的灵敏度。
◆ 案例一
有一次，制剂人员为了了解自己的仿药中用的某个辅料是否与原研一致，根据他们对原研制剂的了解，在自研仿制药处方中加入了相同量的辅料。
分析的结果使他们很诧异，自研辅料检测的结果明显是低于原研的。我仔细检查了检测的数据和计算公式，并未发现任何错误。进而又审阅了方法学验证的所有数据也无懈可击。那是什么原因导致自研处方该辅料含量的结果低呢?
我提出再检查一遍图谱，发现图谱上峰的后面还有一个峰，怀疑是该辅料的同系物。根据它稍延后的保留行为，我提出要在原来辅料的基础上关注比辅料分子量大28的分子离子，在质谱上最后确认了这个多余的峰是原辅料的同系物杂质，而且含量还很高，这不仅解释了制剂人员的疑虑，还提醒我们，分析人员不仅要看所得出的数据，还应该对图谱进行分析，不能忽略任何一个峰。
◆ 案例二
第二个例子是安捷伦工程师和我讨论他们在研究罗库溴铵方法时所遇到的问题，这是一个很奇怪的分析方法, 固定相和流动相条件的选择都匪夷所思。从典型色谱图看到在死体积之前有一个峰，根据我的经验判断这是一个真实存在的峰，不是伪峰也不是死体积出的单纯不保留物质的峰。由于所用的流动相是中性的(pH7.4)，直觉告诉我这个物质应该是带负电荷的离子。我建议将pH降到酸性，这个物质应该就会有保留。
果然他们随后的试验验证了这个推断，而且确认是溴离子。我得出这个结论主要依靠计算和比较洗脱体积与死体积的大小来判断是否有保留。
那为什么会出现在死体积之前出峰的情况呢(洗脱体积小于死体积)?
这是因为在中性条件下，溴离子不但没有保留，而且它与去质子化的硅醇基(带负电)还有静电推斥的作用。因此，优秀的分析人员应当能想象出进样前后整个色谱体系的动态状况，能够将所学过的各种知识融会贯通，解释各种现象，更重要的是能解决各种问题。
这使我想到了某药企的研发和工厂在方法转移时OOS调查的情况，他们也是发现在死体积前面出了个峰，于是做了很多试验，最后发现这是前面产品清洁验证所用的表面活性剂的残留所产生的峰。
如果具有一定的色谱理论知识和实践经验，就能从化合物、流动相和色谱柱的综合信息上分析来判断各物质的保留行为。
我觉得，搞分析的人方法做不好的主要原因还是理论基础不扎实，更缺乏将所学过的各种普通知识有针对性地指导各个特殊的案例的能力。
Q 药研江湖
其实我有一个感受，虽然我们现在做药学吧，但有机化学才是一切的基础。如果有机化学学不好，就很难对这些问题进行分析判断。
根据刚刚老师您给我们举的两个例子，我总结了，我们在做分析工作的时候，不应该仅仅关注于它的数据，但是很多分析工作者都只关注了数据。我们应该更加着重关注图谱和原理，从理论上分析了解为什么会出现这样的数据结果。对么?
A 肖柏明老师
对！你看到任何情况，不要轻易下结论，尤其是出现了跟你想象不一样的结果的时候，要仔细去分析，要判断这个结果是否是可重现的。如果这个结果不是可重现的，那么其中一定是有一些未知因素影响。
昨天在我的讲座中，我讲了三方面的内容。我们分析方法有三类错误，一个是方法有先天性不足的严重错误;第二个是方法带有系统性的错误;第三个是随机误差。
先来说说第一类错误，在建立方法的时候，我们应该建立有稳定性指示的方法。因为化学的本质是形成新的物质，当你的色谱方法不能在含量下降的时候告诉你什么样的新物质生成了，这样的色谱方法就变成了聋子瞎子。所以，我们的分析工作人员应该建立有稳定性指示的方法。
再来说说第二类错误，系统性误差，这一类错误不容易被发现，但是一旦解决，所有的问题也都迎刃而解了。这一类错误的RSD和SD也很低，但是这是被一种假象所掩盖的。
第三类错误，一般是由于操作不当或忽略一些因素的时候频繁出现的问题，比如重复性差。因为当结果非常接近真实值的时候，它的RSD就会变得很低。
我们的分析方法，包括提取条件和色谱条件，对于酸性或碱性基团的分离，都会影响最终结果。 我们药典中有一些方法(带有明显的酸碱基团)，流动相竟然没有缓冲系统，这是极其危险的，有可能色谱体系处在完全或局部失控的状态。
当进样品后，样品的酸碱性会或多或少地影响流动相的pH，可以想象色谱柱从头到尾每个部位的pH都可能会差别，这样的pH环境对于样品在色谱柱上的保留行为是有不同影响的，所以我们就遇到某些方法主峰或杂质峰保留时间漂移不定的情况。
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