4月，药研江湖参加了第九届仿制药峰会，有幸对知名分析专家肖柏明老师进行了采访。
肖柏明老师主要针对以下三方面进行了分享：
(1)反向工程中常规性的研究有哪些?分析人员在反向工程中的价值和参与形式。
(2)分析方法转移时的注意事项。
(3)实际项目案例分析。
今天继续昨天的参访内容，今天刊登的是“分析方法转移时的注意事项”
左：肖柏明老师 右：铭研医药CEO何小炳先生
肖柏明博士，南京柏贤医药总经理，先声药业前执行技术总监。美国西东大学(新泽西州)化学博士和MBA学位。
加入先声之前，他有着12年的制药研发的工作经历，先后在美国的百时美施贵宝、强生从事分析和项目管理工作。肖博士是分析研发的专家，他对于各种各样法规性文件有着逻辑性认识和综合性知识。
2010年加入先声起至今，肖博士在创新药和仿制药开发中担任更多重要的职务。他领导先声-百时美施贵宝合作项目如BMS-817378，CETP以及Orencia。肖博士受邀就分离理论和实践，分析方法论，和杂质谱雅安就的系统化方法做过许多学术演讲。
Q 药研江湖
谢谢老师!接下来我们进行第二个问题。
我们现在有很多药厂会委托一些研究所进行研发工作，但是当研发工作结束之后，我们需要将这些分析方法都转移到药厂。
请问老师，在做方法转移的时候，我们需要做哪些验证性的项目?是全部都要做呢，还是只需要做其中一部分，比如精密度、耐用性、灵敏度。
A 肖柏明老师
这是一个非常好的问题，我遇到很多人都在问这样的问题。
方法转移其实与方法的形成有关。
如果是药典方法，并且你在研发过程中确认这个方法。证明药典方法可以在你的实验室(或工厂、CRO等)使用来检测该品种。 根据USP1226，CRO或工厂确认可以重现这个方法。每个单位都是简单地确认药典方法，不存在相互之间转移的问题。
如果在确认的过程中，发现该方法不能解决你出现的所有的问题，因为可能会出现工艺不同或条件不同，需要微调和改变色谱条件的情况。在这种情况下进行的局部和较大的调整，这时候出来的方法可能跟药典的方法不完全一致了，就需要对优化以后的方法进行验证。
在这样情况下，把方法转移给工厂的时候，根据USP1224中记载的三种方法：对比测试;共同验证;重新验证(一般不太适用)。我个人建议仔细阅读USP1224，它里面有一些详细的规定。另外，概念一定要清楚，什么情况下叫确认，什么情况下叫验证。
尽管它的表现形式不同，但是内容上还是有共同点的。USP1224讲方法转移，1225讲验证，1226讲确认。这些资料看完之后，概念上就会比较清楚了。
提示
关注公众号‘药研江湖’，并在后台回复“方法转移”，下载USP1224、1225、1226文件及中文译稿。
Q 药研江湖
有一个项目，盐酸氨基葡萄糖，在溶出方法开发的过程中，对USP中本来记载的方法进行了微调。在pH1.2条件下，溶剂峰无法分离，主药的峰响应值达到本身的40倍以上。我们使用的是氨丙基填料的色谱柱，而USP上是氨基填料的色谱柱。在这个情况下，流动相需要怎么调整?
A 肖柏明老师
使用这类色谱柱，保留原理是以氰键作用为主的。由于这个产品本身是极性小分子，氨基葡萄糖就是葡萄糖分子的一个羟基被氨基所取代，因此它的保留和pH也有关系。
在酸性流动相条件下，氨基质子化减少其保留，现在使用的流动相是什么?
Q 药研江湖
水相是pH3.0的磷酸盐缓冲液，有机相是乙腈，25:75。原方法是pH7.5的缓冲液。
A 肖柏明老师
建议可以试不同pH的流动相缓冲液，增加pH可以增加其保留。
使用氨基柱氰键作用就是主要作用。由于甲醇是氢质子供体，而乙腈是氢质子得体，因此可以比较用甲醇代替乙腈或用不同比例的甲醇和乙腈来优化保留和分离。
Q 药研江湖
接下来是我们一个客户的问题，他们用HPLC法测定一个药品中的17个杂质，其中12个是已知杂质，并且已经购买了对照品进行研究了。还有5个是未知杂质，且都是降解杂质。
在加速1,2,3,6个月的试验中发现，自研样品的未知杂质的增长趋势与参比制剂相同。无论是参比制剂还是自研样品中，未知杂质都超过了鉴定限但是没有达到质控限。但是参比制剂并没有对这5个未知杂质进行研究，那我们现在需要对这5个未知杂质进行研究么?
A 肖柏明老师
这个肯定是要研究的。如果没有达到鉴定限，可以用RRT来表示。但是对于一些特殊条件应予以重点关注，比如对该品种有实际意义的破坏试验，另外，如果在稳定性试验中，该杂质涨的很快，那就要结合温度40℃湿度75%或者更加苛刻破坏的条件下的情况。什么条件最合适?这是需要根据你所研究的化合物的特性所决定的。
Q 药研江湖
另一个项目中，一共有14个杂质，其中一个已知杂质与另一个未知杂质无法达到基线分离，这种情况下应该如何操作?
A 肖柏明老师
按目前的审评要求，尽量能完全分离，特别是那些在长期稳定性甚至加速试验中都不出现的降解杂质，如果分离度达不到1.5也不是什么大问题。
我认为更重要的是要看方法的耐用性如何，如果方法只能在“理想”的情况能做到基线分离，但不能保证在所有情况下都能做到就是大问题了!这个所谓的“理想方法”却恰恰暴露了它耐用性差的缺点。
我想顺便说一下关于基线分离的概念：主峰和杂质达到基线分离是必须的。什么叫做基线分离?通常情况下，大家理解的基线分离就是分离度达到1.5。那么分离度大于1.5的数学依据是什么?大部分人都会给我下面这个公式：
Rs=2*(tR2-tR1)/(W1+W2)(1)
当w1=w2的时候，上面的公式就变成了：
Rs=(tR2-tR1)/W>1.5
即：tR2-tR1>1.5W
w是峰宽，它的定义是：在10%的峰高处，峰的宽度。
W=4σ
一个σ是多少?是覆盖掉整个正态分布下67%的面积。那么，2σ就覆盖了95.4%;3σ就覆盖了99.7%。两个SD已经满足了统计学的假设前提，即分离度达到1.0的时候已经满足条件了。从这个意义上讲，我个人认为：如果在任何情况下都能保证两个相邻的杂质的分离度均能满足1.0引起定量方面的差别也是非常小的。关于分离度，我更喜欢另外一个公式，即
只有将公式1转化为公式2，才能从热力学和动力学两个方面分析可能会影响分离度的因素。
记得当年在美国读书时担任TA，看到本科仪器分析教材里就有这段公式转换推导，还在实验课上给学生推导过。
热力学是化学因素，动力学是物理因素，什么样的试验条件是对热力学参数产生影响，什么样的试验条件是对动力学参数产生影响，自己心里要有数。最重要的还是理论基础，理论基础不扎实就会导致出现问题之后看不懂，找不到原因，更找不到解决问题的方法。
当然，最重要的是你所建立的方法必须是“傻子”方法，具有非常好的耐用性。对于同样的方法，如果今天你能做到，明天却难保证;今天在你的实验室可以做到，明天到了其它实验室就不应做得到，这就有大问题了!这样就可能出现我上面所讲的由于不在乎第三类问题(随机误差)而最终导致第一类问题(严重错误)的危险。
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