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做液相色谱的同学都知道，液相色谱分离条件中，最重要的参数就是洗脱条件，其中分离条件又分为等度洗脱和梯度洗脱。
是指在样品组分的分析周期中，流动相的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式。
是指在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比的洗脱方式。
在色谱分析时，等度洗脱和梯度洗脱各有优势和劣势。
对于等度洗脱而言，由于方法运行时，流动相的比例不发生变化，所以它对仪器的要求不高，只需要一个单元泵就可以运行方法。
其次，由于等度洗脱条件单一，所以比较容易用来摸索方法设置，例如改变流动相比例，改变柱温等条件。
并且由于等度洗脱每次运行时的流动相比例相同，所以相同方法运行多个样品时，样品之间不需要设置平衡时间来让系统恢复到所需的流动相比例。
但是它也有缺点，那就是越往后出峰的组分色谱峰越宽。
并且大多数等度洗脱的方法分析时间较长。
而梯度洗脱能够规避掉等度洗脱的问题，例如梯度洗脱的样品峰，无论先出峰还是后出峰的组分，它们的峰形基本都能保证尖锐对称。
其次由于梯度洗脱通常设置的流动相比例是让洗脱强度越来越强，这样能保证在较短的时间内，让样品中强保留组分也能被洗脱出来。
但是伴随着这些优点也会有对应的缺点，首先它对仪器的配置要求较高，通常需要配置四元泵或者二元泵。
其次它在每次运行样品之间，需要设置一定的平衡时间，来让系统中流动相的比例到达初始流动相比例。
最后，由于它的方法设置复杂，例如影响分离的有初始流动相比例、流动相的梯度变化、结束流动相比例、柱温箱温度等，所以方法的开发和优化会较为复杂。
了解了这么多等度洗脱和梯度洗脱的优缺点，很多同学可能会有疑问，我如何知道我的样品适合等度洗脱还是梯度洗脱呢?
不用着急，这是有规律可循的。
对于常规样品而言，建议大家在初始设置方法时可以先参考以下初始条件运行：20分钟内，将有机相比例从5-10%线性升高至100%，并保持一段时间以保证所有组分被洗脱出来。
如果在梯度结束后，有组分的洗脱时间超过梯度时间的25%，也就是该条件中如果有化合物在25分钟之后被洗脱出来，则需要考虑更换保留能力更弱的色谱柱或更换极性更强的有机溶剂。
我们可以通过以下公式来计算：
我们可以看出 ΔtG>0.25 tG，所以该方法不适合等度洗脱。
适合等度洗脱的方法要求 ΔtG<0.25tG。
如果你的方法适合等度洗脱，那么又该如何设置呢?
我们还以上面的这个样品为例，可以参考如下计算：
tr(avg)=(ti+tf)/2=17min
Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min
等度洗脱流动相比例=(Δ%B/min x tr(avg))+%Binitial=(4.75x17)+ 5=85.75≈86%B
综上所述，如果该样品可以用等度洗脱，那么方法设置为：水相与有机相比例为14：86，保持17min。
同学们在做方法设置时可以参考以上条件设置，如果做出来的图形不能完全满意，在此基础上微调即可。
如果该样品需要做梯度洗脱，方法参数又该如何设置呢?
梯度洗脱主要包括以下几个参数：初始流动相比例、结束流动相比例和流动相变化速率，同样以之前的样品为例：
Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min
调整后的初始流动相比例
Optimized%Binitial
=(%Binitial+(tixΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B
=(5+(12.786x4.75))-(5.5/2x4.75)-10
=42.67%B
调整后的结束流动相比例
Optimized%Bfinal
=(%Binitial+(tfxΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B
=(5+(21.142x4.75))-(5.5/2x4.75)-10
=82.36%B
通过计算得到调整后的初始流动相比例等于42.67%，调整后的结束流动相比例等于82.36%。
如果按照以上计算出来的条件，流动相从42%到83%，运行时间20min，得到的样品图如下所示：
在方法开发时，同学们可以在以上基础谱图下再次进行调整，直到达到满意的分离度和分析时间。
关于等度洗脱和梯度洗脱的方法设置，今天就讲到这里，谢谢观看。
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